Hoe een ELISA assay

Een ELISA of enzym-gekoppelde immuno-absorberende test , is een biochemische laboratorium techniek gedaan om een antigeen ( bijvoorbeeld een eiwit ) of antilichaam te detecteren in een experimenteel monster. De assay maakt gebruik van antilichaam - antigeen- bindend en kunnen worden gebruikt om andere cellulaire en moleculaire mechanismen binding assay ook. In een eiwit gebaseerde ELISA assay een " vastleggen " antilichaam of eiwit in een assay schaal gelegd en te hechten aan de schaal , waarna de " probe " middel (zoals iemands eiwit van belang ) is voorgeschreven en geïncubeerd met de capture -agent . Na enkele wasbeurten , een " opsporing " antilichaam wordt toegevoegd teneinde de aanwezigheid of afwezigheid van antilichaam - antigeen of eiwit - eiwitbinding te visualiseren . Wat je nodig hebt
Assay gerecht ( bijvoorbeeld 96-wells blok ) op Capture antilichaam ( verdund tot 5 ug /ml in 50 mM NaHCO2 , pH 9,6 ) op Twitter Probe antilichaam /eiwit ( verdund tot verschillende concentraties ) op detectie antilichaam ( bijvoorbeeld mierikswortel - peroxidase gekoppeld antilichaam ) op PT -buffer ( 1x PBS , 0,05 procent Tween - 20 ) op Blocking buffer ( 1x PBS met 5 mg /ml BSA , en 5 procent afgeroomde melk in 1x PBS ) op Twitter Detection reagens ( dwz TMB reagensmengsel ) op Twitter Mechanische lab shaker
Koude kamer of koelkast
Pipetten en tips
Toon meer instructies

1

Verdun vangantilichaam tot 5 ug /ml in 50 mM NaHCO2 ( pH 9,6 ) . Voeg 50 ul aan elk putje van de schaal voor monsters voor het testen . Dek af met plastic of aluminium en incubeer overnacht bij 4 graden C op een schudder . Kopen van 2

Dump uit capture antilichaam en was twee keer met 200 uL PT buffer. Voeg 200 ul van het blokkeren van buffer per putje ( PB of 5 procent magere melk ) . Incubeer overal van twee uur 's nachts , terwijl schudden bij 4 graden C.

Dump 3 blokkeringsbuffer en was 4 keer met 200 uL PT buffer. Voeg " probe " eiwit monsters bij verschillende concentraties in PB of 5 procent magere melk , toevoeging van 100 ul per putje . Incubeer een uur schudden bij 4 graden C. Giet leeg sonde oplossingen en was zes keer met 200 uL PT buffer.
4

toevoegen detectieantilichaam ( HRP - geconjugeerd antilichaam ) verdund 1:4000 in PB buffer of 5 procent afgeroomde melk ( of een met 0,05 procent Tween - 20 ) , toevoeging van 50 ul per monster ook. Incubeer gedurende 30 minuten tot een uur schudden bij 4 graden C.
5

Dump uit detectieantilichaam oplossing en was 6 maal met 200 uL PT per putje , gevolgd door wassen twee keer met 200 ul van 1x PBS ( fosfaatgebufferde zoutoplossing ) . Dump uit PBS en voeg 100 ul van detectiereagens per putje ( voor HRP , gebruik vers gemengde TMB reagens door het mengen van TMB substraat en peroxide op 1:1 ) . Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur , schud af en toe .

bij gebruik TMB en HRP : voeg tenslotte 100 pl 1 M H3PO4 ( fosforzuur ) per putje om de reactie te blussen TBM

Lees plaat met monsteranalyse lezer , zoals een 96 -well plaatlezer . . ( Voor de HRP en TMB , gebruik de " ELISA eindpunt Assay " template beschikbaar op de meeste lezers. ) Op