Cryopreservatie Procedures

Cryopreservation procedures zijn die toelaten cellen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen met behulp van extreem koude temperaturen om metabolische activiteiten opschorten. Er zijn twee hoofdtypen van cryopreservatie procedures: evenwicht (conventionele langzaam invriezen) en niet-evenwichts-of ultra-snel invriezen (vitrificatie). De term verglazing komt van het Latijnse "glazige" of glazig. Beide procedures gebruiken cryoprotectants met antivries-type verblijven om cellulaire schade tijdens het invriezen te voorkomen. Zodra cellen worden ingevroren en verglaasd, kunnen ze oneindig worden bewaard door onderdompeling in vloeibare stikstof, een extreem koude vloeistof met een temperatuur van -196 C (-321 F). De metabole activiteit in de cel herstel na ontdooien, moet toxische cryoprotectants worden verwijderd uit de cel en de normale vochtbalans geleidelijk hersteld als de cel weer in een normale werking temperatuur. Overzicht
Overzicht

Cryopreservation procedures
zijn die toelaten cellen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen met behulp van extreem koude temperaturen om metabolische activiteiten opschorten. Er zijn twee hoofdtypen van cryopreservatie procedures: evenwicht (conventionele langzaam invriezen) en niet-evenwichts-of ultra-snel invriezen (vitrificatie). De term verglazing komt van het Latijnse "glazige" of glazig. Beide procedures gebruiken cryoprotectants met antivries-type verblijven om cellulaire schade tijdens het invriezen te voorkomen. Zodra cellen worden ingevroren en verglaasd, kunnen ze oneindig worden bewaard door onderdompeling in vloeibare stikstof, een extreem koude vloeistof met een temperatuur van -196 C (-321 F). Om metabolische activiteit in de cel te herstellen bij het ontdooien, moeten toxische cryoprotectants worden verwijderd uit de cel en de normale waterhuishouding geleidelijk hersteld als de cel wordt teruggekeerd naar een normaal functionerende temperatuur.
Cel- Specifieke factoren

De procedure voor cryopreserve cellen of weefsel hangt af van een aantal factoren, waaronder de grootte van de cel, de hoeveelheid cellulaire vloeistof (cytoplasma) en de complexiteit van de cel (cel of weefsel). Cellen met een grote hoeveelheid cytoplasma zoals eieren zijn moeilijker te cryopreserve dan cellen met alleen resterende cytoplasma, zoals zaadcellen. Cryopreservatie van ovarieel weefsel is moeilijker omdat minstens drie verschillende celtypes van verschillende grootte aanwezig in ovariumweefsel, elk met verschillende optimale bevriezen behoeften. Langzaam invriezen protocollen zijn met succes gebruikt met verschillende soorten cellen. Verglazing momenteel is het meest effectief met eencellige invriezen en minder effectief met weefsels, maar het onderzoek is aan de gang om vitrificatie van weefsels optimaliseren.
Rol van cryoprotectants

Het cytoplasma van een cel bevat water, die overgaat tot ijskristallen bij vriestemperatuur. Toen het ijs vormt in een cel, de cel is versnipperd en sterft. Daarom is de vloeistof in de cel moet worden verwijderd voorafgaande aan het bereiken vriestemperaturen celbeschadiging voorkomen. Verschillende soorten antivries (cryoprotectant) vloeistoffen kunnen worden gebruikt om de cellen voor het invriezen, waaronder glycerol, propaandiol, dimethyl sulfoxde (DMSO), ethanol en suikers zoals sucrose en trehalose uitdrogen. De optimale koelsnelheid (en ontdooien) afhankelijk van het type van het koude beschermend gebruikt en de karakteristiek van de cel of weefsel (of dat was) bevroren. Cryoprotectants zijn giftig voor het metaboliseren van cellen, zodat cel blootstellingen aan cryoprotectants bij warmere temperaturen metabole minimum moeten worden beperkt of vermeden. Na ontdooien of opwarmen van de cellen, moet cryoprotectants volledig verwijderd worden uit de cel voordat metabolische activiteit wordt hersteld.
Equilibrium Versus Non-Equilibrium Cryopreservation Procedure

De snelheid van invriezen afhankelijk of de bevriezing protocol evenwichts-of niet-equilbrium gebaseerd. Bij evenwicht soort procedures, wordt de optimale vriessnelheid is wanneer er een evenwicht tussen de snelheid waarmee de cel te drogen water en de snelheid waarmee water buiten de cel wordt getransformeerd naar het ijs fase. Deze evenwicht of slow-vries protocollen meestal uren in beslag nemen en een computer wordt gebruikt om een ​​programmeerbare frequentie vriezer uitvoeren om ervoor te zorgen dat de bevriezing tarieven zijn precies zoals vereist. Er is typisch een "hold" stap in het protocol bij de start van het handmatig maken van starter ijskristallen of "zaaien" in de vloeistof buiten de cellen mogelijk.

Vitrificatie, een geheel andere benadering bevriezing dat niet afhankelijk hellingen en tot een evenwicht tussen uitdroging en ijskristalvorming gebruikt. Vitrificatie is zo ultra-snel dat er onvoldoende tijd is voor ijsvorming en de cellulaire vloeistof wordt direct omgezet in een glasachtige of glas fase, zonder schade aan de cel. Programmeerbare frequentie vriezers zijn niet nodig, omdat de cel wordt direct ondergedompeld in extreem koude vloeibare stikstof, het bereiken van een ogenblikkelijke glasachtige toestand.
Slow-Freeze Procedure

De eerste stap van het langzaam bevriezen procedure is de cel blootstellen aan koude beschermend geleidelijk stapsgewijs langzaam laten evenwichtsinstelling van de cel met de koude beschermende onder het afstaan ​​water. Zodra de cellen werden vrijgemaakt van de meeste cellulaire water, worden de cellen in het koude beschermend fluïdum in een houder geplaatst van een soort, zoals een rietje, een glazen ampul of een plastic vial.The volume vloeistof rond de cellen gedurende langzaam invriezen is meestal minder dan een theelepel en mag alleen een paar druppels. De pre-geëtiketteerde container is gevuld, afgesloten en in een programmeerbare vriezer, die langzaam vermindert de temperatuur van de container over een periode van minuten of uren tot zeer lage temperaturen. Na enkele minuten koelen dient starter ijskristallen in de houder worden gevormd door "zaaien" van de container. Zaaien wordt uitgevoerd met een programma (bijvoorbeeld forceps) die vooraf gekoeld in vloeibare stikstof om de houder raken en veroorzaken ijskristalvorming. Deze starter kristal zal gecontroleerd ijskristalvorming initiëren op een plek, een veilige afstand van de cellen. Zodra zaaien is voltooid, kan de rest van de koeling hellingen gaan. Wanneer de container temperaturen tussen -30 en -85 C bereikt, de container met de cellen kan worden rechtstreeks in vloeibare stikstof gedompeld om de koeling te voltooien tot -196 C.
Verglazing

Zeer snelle non-equilibrium koelen procedures zoals vitrificatie gebruiken hogere concentraties cryoprotectants gekoppeld aan een bijna onmiddellijke bevriezing tarief bereikt door kelderen cellen direct in vloeibare stikstof. Verglazing omzeilt het ijs-kristalvorming fase en beweegt het water direct in een glasachtige fase. Verglazing heeft hetzelfde eindpunt zo langzaam bevriezen, maar met een snelheid van -3000C/min tegenover 10C/min of meer. Voor verglazing worden cellen meestal geplaatst op het uiteinde van een rietje en overmaat koude beschermend middel wordt verwijderd, waardoor net genoeg zodat de cel vast aan de houder van oppervlaktespanning, voor dompelen in vloeibare stikstof. Omdat zo snel invriezen, de duur van de blootstelling aan koude beschermende veel minder, en veel hogere concentraties van koude beschermende middelen kan worden getolereerd door de cellen. Opwarming van de cel om het terug te keren naar de normale metabolische werking moet ook ongelooflijk snel. Behandeling met verglaasd monsters veel strenger dan langzaam ingevroren monsters omdat zelfs een korte blootstelling aan een temperatuur boven die van vloeibare stikstof kan een ongeplande opwarmingsproces en opnieuw invriezen, hetgeen schadelijk is voor de cel gaan.