Cel - gebaseerde ELISA protocol

ELISA of enzymgekoppelde immunosorbent assay wordt gebruikt als een diagnostisch hulpmiddel in de geneeskunde en biologisch onderzoek om de hoeveelheid van een specifiek eiwit te kwantificeren . ELISA gebruikt antilichamen tegen het eiwit van belang en een reagens dat een kleur produceert detecteren . De hoeveelheid kleur betreft de hoeveelheid eiwit . Celkweek

Cellen moeten in de putjes van een 96 -well plaat met 100 micro - liter kweekmedium en de cellen gedurende de nacht bezinken . Als je studeert de cellen ' reactie op een factor, cellen - serum uitgehongerd voor 24 uur en vervolgens gestimuleerd met de factor in studie zijn.
Fixatie en primair antilichaam

Na verwijdering van het medium , de cellen behandeld met een fixeermiddel zoals 3 procent formaldehyde of methanol . De celmembraan moet permeabel zodat het antilichaam aan de cel penetreren . Permeabilisatie kan worden bereikt door het gebruik van 0,1 procent Triton , indien methanol niet eerder is gebruikt . Niet-specifieke binding kan worden voorkomen met het gebruik van 10 procent foetaal kalf serum verdund in fosfaat gebufferde zoutoplossing . Na verwijdering van het blok , kan het primaire antilichaam worden toegepast en gedurende een uur .
Secundair antilichaam en Stain

Verwijder het primaire antilichaam , en wassen drie keer . Een secundaire antilichaam gekoppeld aan een detectiemiddel , zoals mierikswortelperoxidase . Incubeer gedurende een uur. Wash toevoegen chemiluminescente substraatoplossing . Ontwikkelen en scan de plaat voor kleurintensiteit .