Hoe Antilichaam verdunningen IHC Voeg

immunohistochemie ( IHC ) is een gespecialiseerde techniek die door wetenschappers cellen in weefsels die op een slede geplaatst en gekleurd met een geschikt antilichaam dat een eiwit dat uniek is voor de cel of weefsel onder herkent visualiseren onderzoek. Antilichaam verdunningen ( titraties ) , wordt uitgevoerd met de experimentele omstandigheden in eigen protocol van de gebruiker , niet die van de fabrikant van het antilichaam , aangezien de twee niet identiek zijn . Wat je nodig hebt
Cellen om vlekken
Antibody
Verdunningsbuffer ( " verdunningsmiddel " ) op Twitter Pipetten en tips
microfugebuis
Aluminiumfolie
markers Lab en tube labels
Ice
licht - beschermde preparaatdozen
Toon meer instructies
1

controleren en bereiden het antilichaam . Controleer of het antilichaam is opgewekt in de juiste gastheer , en reageert met de exacte versie van het eiwit ( bekend als de isovorm of splice variant) dat wordt getest . Met behulp van een pipet voorzichtig een 10 microliter deel van dit label en neem als ' persoonlijke voorraad ' .

Als slechts zeer kleine hoeveelheden antilichamen beschikbaar zijn, deze stap overslaan.

Bijhouden van een persoonlijke voorraad antilichaam is dagelijkse praktijk in alle laboratoria omdat het voorkomt kruisbesmetting van de oorspronkelijke voorraad . Verdeel dit in een licht - beschermde microfugebuis , of een normaal microfugebuis die is verpakt in aluminium folie ter bescherming tegen direct licht .

Houd deze buis op ijs , bij voorkeur in een Esky met een luchtdicht deksel , opnieuw licht te minimaliseren , die het antilichaam kan vernietigen . Maak een notitie van de concentratie van de oorspronkelijke stam (bijvoorbeeld 100 eenheden per milliliter , 1 milligram per microliter enzovoort ) op de buis , met inbegrip van de naam van het antilichaam en wat eventuele buffer wordt in (bijv. serum , zoutoplossing verdund , of water enz. ) . kopen van 2

Bereid de verdunning buffer , ook wel bekend als de antilichaamverdunner . Controleer of dit verenigbaar is met het antilichaam en de immunohistochemie procedure wordt gebruikt , bijvoorbeeld , het moet geen fluorescentie verhullen of voor eventuele latere secundaire antilichaam labeling remmen. Wordt standaard immunohistochemie verdunning ( ook blokkerende buffer ) door mengen 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing met 1 % Triton - X100 , 10 % foetaal kalfsserum en 0,2 % natriumazide .
3

Titreer de antilichaam. Met de gegeven concentratie van antilichaam in de persoonlijke voorraad ( uitgedrukt in concentratie-eenheden zoals microgram per microliter ) , bepaalt het volume antilichaam nodig is om 10 microgram antilichaam te verkrijgen .

Stel een verdunningsreeks pipetteren volume overeenkomend met 2 microgram antilichaam ( bijv. X microliter ) , 100 microliter verdunningsmiddel en meng door en neer te pipetteren . Van deze beginnend verdunning , nemen dezelfde X microliter en voeg dat toe aan een volgende 100 microliter van verdunner . Herhaal dit tot 8-10 verdunningen ( of reeks ) bestaat .

Laatste buis dus de laagste concentratie en de " verzadigen " concentratie die het hoogste signaal gedurende het experiment zal genereren . Echter, het ideale concentratie iets meer geconcentreerd dan deze , zodat niet teveel signaal wordt geproduceerd , waarbij die fouten kunnen veroorzaken .

Label de buizen kunnen met de nieuwe verdunde concentraties.