Hoe maak je een Drie Fragment Ligering Problemen

eileiders is een methode die wordt gebruikt in biologisch onderzoek voor het samenvoegen van afzonderlijke strengen van het DNA . Het proces is vereenvoudigd behulp van commercieel verkrijgbare kits ligatie . Een ligatie werkwijze wordt meestal gevolgd door transformatie , een werkwijze inbrengen van de verbonden DNA in een bacteriële vector ontvanger te klonen en het amplificeren DNA . Vanwege de complexiteit van het vaak resultaten niet overeen met het gewenste product en vereisen probleemoplossing. Dit is overheersend in een poging om meerdere fragmenten , bijvoorbeeld in drievoudige ligatie sluiten . Wat je
ligatiekit nodig
Ligering protocol
Agarosegel
50 X TBA buffer ( 242 g Tris-base , 57,1 ml ijsazijn , 100 ml 0,5 M EDTA verdund tot 1 liter met water )
gedemineraliseerd water
DNA-zuivering kit
Toon meer instructies Heb Problemen Transformation
1

Formuleer een lijst van de stappen die betrokken zijn bij ligatie en transformatie . Problemen met enig wetenschappelijk protocol algemeen begint met de laatste stap achterwaarts . Kopen van 2

Vergelijk gezuiverd DNA-product van het monster op de controle van DNA , die bij de kit. Zodra DNA is getransformeerd en gekloneerd in bacteriën kan worden geïsoleerd , gezuiverd en gecontroleerd door agarose gelelektroforese . De resultaten voor elektroforese zou aangeven of transformatie succesvol was.
3

Bepaal bacteriële groei tijdens het klonen . De meeste bacteriële vectoren worden geconstrueerd dat alleen degenen met een DNA-insert - zal groeien op een medium dat ampicilline , of andere antibiotica . Poor groei kunnen aantonen dat het DNA-monster in de vector niet met succes werd ingebracht .

Bevestig Goedkope 4 dat de geligeerd DNA-monster werd gezuiverd , voorafgaand aan transformatie. Bufferzouten en ligatie enzymen kan transformatie van het ingebrachte DNA te remmen . Het is ook belangrijk om te controleren of de ligatie enzym werd geïnactiveerd door warmte , na voltooiing van de ligatie -procedure . Actieve ligase zou kunnen interfereren met transformatie.
5

Controleer de datum op bacteriële voorraad gebruikt voor transformatie . Oude bacteriële cellen los efficiëntie in de tijd. Uiteindelijk de bacteriële cellen niet in staat zijn transformatie en kwaliteit klonen . Zodra het proces van transformatie is gediagnosticeerd , kan je beginnen met het analyseren van de ligatie procedure .
Problemen Ligering
6

Bevestig de zuiverheid van uw DNA-monster , voorafgaand aan ligatie . Zout verontreinigingen in het DNA-monster kan leiden tot slechte ligatie . Het DNA monster moet gezuiverd en vrij van zouten en enzymen , voordat het wordt gebruikt in ligatie .

Bevestigen
7 of de uiteinden van DNA strengen te ligeren stomp of plakkerig . Ligatie wordt gebruikt om afzonderlijke strengen verbinden met stompe uiteinden of sticky ends , na digestie met aangewezen restrictie-enzymen . T4 DNA ligase is het enzym van de keuze voor een stomp uiteinde DNA - maar het zal ook werken voor DNA met sticky ends . Andere DNA ligases kan alleen werken voor DNA , na een restrictiedigest om sticky ends maken . Het is belangrijk om de juiste ligase gebruikt voor DNA getest .
8

controleren concentratie van DNA-monsters voor ligatie . Met DNA met hoge concentratie veroorzaakt vaak DNA lineair te worden . De kit instructies zal informatie opleveren over de juiste hoeveelheid DNA te gebruiken in een ligatiereactie .
9

Vervang ligase enzym met een nieuw stuk . Enzymen zijn bijzonder gevoelig op kamertemperatuur en bleef vries - dooi cycli . De ligase kan beschadigd raken na een aantal toepassingen , simpelweg door het invriezen en ontdooien te vaak . Sommige kits raden ligase worden verdeeld in kleinere porties tijdens het eerste gebruik , om het aantal keren dat het is opnieuw bevroren verminderen .
10

Controleer de ligatiekit . Vaak is het probleem met de eileiders wordt met behulp van een kit die is verlopen of is verontreinigd met andere DNA en zouten .