Hoe NADH detecteren

Nicotinamide adenine dinuceltoide ( NADH ) , afgekort " NAD " , een co-enzym in levende cellen die chemische reacties in eiwitten produceert . Farmaceutische bedrijven bestuderen NADH vanwege de stofwisseling en synthetisch creëren voor een aantal doeleinden . Aangezien NADH is microscopisch , kan met het blote oog niet bevlekken . Je moet wetenschappelijke testen en een test kit om zijn aanwezigheid te detecteren . Wat je
droogijs
Micro - centrifuge
Eppendorfbuizen
Toon meer instructies Heb Reagent Reconstitutie
1

Zet de fietsen buffer op Need een teller en laat de buffer op kamertemperatuur komen . De ideale temperatuur voor de buffer is 22 graden Celsius . Kopen van 2

Reconstitueer de NAD fietsen enzym mix met precies 220 microliter fietsen buffer. Bevries de oplossing bij temperaturen onder -70 graden Celsius.

Reconstitueer 3 de NADH ontwikkelaar met 1,2 ml ddH2O . Meng de oplossing tot deze volledig is opgelost . Niet vortex.
4

Reconstitueer NADH standaard met 200 microliter van pure dimethylsulfoxide .
Monsterbereiding
5

Was de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing .
6

Pellet 2x10 ( 5 ) cellen voor elke test in een micro - centrifugebuis en draaien bij 2000 rpm gedurende 5 minuten .
7

Extraheer de cellen met 400 microliter NAD /NADH extractiebuffer door invriezen en ontdooien van de cellen in twee cycli - 20 minuten op droog ijs en 10 minuten bij kamertemperatuur . Vortex de uitgepakte cellen gedurende precies 10 seconden .
8

Spin de cel monsters in een micro - centrifuge bij 14.000 rpm gedurende precies 5 minuten .
9

Breng de NAD /NADH cellen in een schone buis .
Testprotocol
10

Verdun 10 microliter van de NADH standaard met 990 microliter NAD /NADH extractie buffer. Voeg 0 , 2 , 4 , 6 , 8 , 10 microliter van de verdunde oplossing in een 96 -wells plaat in tweevoud maken 0 , 20 , 40 , 60 80 , 100 ook standaard . Vul het laatste goed met 50 microliter van NAD /NADH extractiebuffer .
11

Overdracht 50 microliter van het geëxtraheerde cel monsters in een 96 -wells plaat in duplo als hiervoor .
12

Bereid de cel monsters voor NADH detectie. Ontleden de NAD uit de cel monsters door de invoering van 200 microliter van het gewonnen cel monsters in eppendorfbuisjes . Verwarm de buizen tot 60 graden celsius gedurende 30 tot een temperatuur gecontroleerde waterbad minuten. Snel afkoelen van de monsters door het plaatsen van de buizen op ijs . Spin de monsters in de micro - centrifuge om neerslagen te verwijderen . Overdracht 50 microliter van de ontlede monsters in een 96-well plaat in duplicaten als voorheen .
13

Meng de NAD fietsen buffer mix met 100 microliter van NAD fietsen buffer mix en 2 microliter van NAD fietsen enzym. Voeg 100 microliter van deze nieuwe oplossing in elk putje van NADH standaarden en monsters .
14

Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende precies 5 minuten . Dit proces zal de NAD converteren naar NADH .
15

Voeg 10 microliter van NADH ontwikkelaar in elke goed . Laat de plaat te zitten bij kamertemperatuur gedurende een minimum van 1 uur en een maximum van 4 uur .
16

Lees de plaat en bereken de NADH .