Cryopreservatie Procedures

Cryopreservation procedures zijn die cellen mogelijk maken om voor onbepaalde tijd worden opgeslagen met behulp van extreem koude temperaturen om metabolische activiteiten op te schorten . Er zijn twee hoofdtypen van cryopreservatie procedures : evenwicht ( conventionele langzaam invriezen ) en niet-evenwichts -of ultra - snel invriezen ( vitrificatie ) . De term verglazing komt van het Latijnse " glasachtig " of glazig . Beide procedures gebruiken cryoprotectants met antivries -achtige eigenschappen om cellulaire schade tijdens het invriezen te voorkomen . Zodra cellen worden ingevroren en verglaasd , kunnen ze voor onbepaalde tijd worden opgeslagen door ze onder te dompelen in vloeibare stikstof , een extreem koude vloeistof met een temperatuur van -196 C ( -321 F) . Om metabolische activiteit te herstellen in de cel bij het ontdooien , moet toxische cryoprotectanten uit de cel verwijderd en de normale vochtbalans geleidelijk terug de cel weer in een normale werking temperatuur . Overzicht
Overzicht

Cryopreservation procedures zijn die cellen mogelijk maken om voor onbepaalde tijd worden opgeslagen met behulp van extreem koude temperaturen om metabolische activiteiten op te schorten . Er zijn twee hoofdtypen van cryopreservatie procedures : evenwicht ( conventionele langzaam invriezen ) en niet-evenwichts -of ultra - snel invriezen ( vitrificatie ) . De term verglazing komt van het Latijnse " glasachtig " of glazig . Beide procedures gebruiken cryoprotectants met antivries -achtige eigenschappen om cellulaire schade tijdens het invriezen te voorkomen . Zodra cellen worden ingevroren en verglaasd , kunnen ze voor onbepaalde tijd worden opgeslagen door ze onder te dompelen in vloeibare stikstof , een extreem koude vloeistof met een temperatuur van -196 C ( -321 F) . Metabole activiteit in de cel bij het ontdooien te herstellen, moet giftige cryoprotectants worden verwijderd uit de cel en de normale waterbalans geleidelijk hersteld als de cel wordt teruggebracht naar een normale werking temperatuur .
Cel - specifieke factoren

de procedure voor cellen of weefsels cryopreserve afhankelijk van een aantal factoren, waaronder de grootte van de cel , de hoeveelheid cellulaire vloeistof ( cytoplasma ) en de complexiteit van de cel ( cel of weefsel) . Cellen met een grote hoeveelheid cytoplasma zoals eieren zijn moeilijker te cryopreserve dan cellen met slechts resterende cytoplasma , zoals zaadcellen . Cryopreservatie eierstokweefsel is moeilijker omdat minstens drie verschillende celtypen van verschillende grootte die in eierstokweefsel , elk met verschillende optimale bevriezen behoeften . Langzaam invriezen protocollen zijn met succes gebruikt met verschillende typen cellen . Verglazing momenteel is het meest effectief met single- cell invriezen en minder effectief met weefsels , maar het onderzoek is aan de gang om vitrificatie van weefsels optimaliseren.
Rol van cryoprotectants

Het cytoplasma van een cel bevat water, dat verandert in ijskristallen bij vriestemperatuur . Wanneer ijs vormt in een cel , wordt de cel versnipperd en sterft . Daarom is de vloeistof in de cel moet worden verwijderd voorafgaand aan het bereiken vriestemperaturen tot celbeschadiging voorkomen . Verschillende soorten antivries ( cryoprotectant ) vloeistoffen kunnen worden gebruikt om de cel dehydrateren voor het invriezen , zoals glycerol , propaandiol , dimethyl sulfoxde ( DMSO ) , ethanol en suikers zoals sucrose en trehalose . De optimale koelsnelheid ( en ontdooien ) afhankelijk van het type koude beschermend gebruikt en de karakteristiek van de cel of weefsel (of dat was ) bevroren . Cryoprotectants zijn giftig voor het metaboliseren van cellen, zodat cel blootstellingen aan cryoprotectants bij warmere temperaturen metabole minimum moeten worden beperkt of vermeden . Bij het ontdooien of verwarmen van de cellen, moet cryoprotectants volledig worden verwijderd uit de cel voordat metabolische activiteit wordt hersteld .
Equilibrium versus niet - Equilibrium Cryopreservation Procedure

De snelheid van invriezen afhankelijk of de bevriezing protocol evenwicht of geen equilbrium gebaseerd. Voor evenwichtstype procedures , wordt de optimale invriessnelheid bereikt wanneer er een evenwicht tussen de snelheid waarmee de cel wordt uitgedroogd water en de snelheid waarmee water buiten de cel wordt getransformeerd naar het ijs fase . Deze evenwicht of langzaam invriezen protocollen uur meestal in beslag en een computer wordt gebruikt om een ​​programmeerbare frequentie diepvriezer om te verzekeren dat de vriessnelheden precies zoals vereist . Er is meestal een " hold " stap in het protocol in de buurt van het begin tot het handmatig maken van starter ijskristallen of " seeding " allow in de vloeistof buiten de cellen .

vitrificatie , een geheel andere benadering tot bevriezing die niet afhankelijk hellingen en het bereiken van een evenwicht tussen uitdroging en ijs kristalvorming wordt gebruikt . Vitrificatie is zo ultra - snel dat er onvoldoende tijd is voor ijsvorming en de cellulaire vloeistof wordt direct omgezet in een glasachtige of glas fase , zonder schade aan de cel. Programmeerbare frequentie vriezers zijn niet nodig omdat de cel wordt direct ondergedompeld in extreem koude vloeibare stikstof , het bereiken van een ogenblikkelijke glasachtige toestand .
Slow - Freeze Procedure

De eerste stap van de slow -vries procedure is om de cel bloot te stellen aan cryoprotectant in een geleidelijke stapsgewijze manier om verevening van de cel langzaam mogelijk met de cryoprotectant terwijl het vrijgeven van water . Nadat de cellen zijn ontdaan van de meeste cellulaire water , worden de cellen in het koude beschermend fluïdum geplaatst in een houder van een soort , zoals een rietje , een glazen ampul of een plastic vial.The volume vloeistof rond de cellen langzaam invriezen is meestal minder dan een theelepel en mag alleen een paar druppels . De gelabelde container is gevuld , afgesloten en in een programmeerbare vriezer , die langzaam vermindert de temperatuur van de container over een periode van minuten of uren tot zeer lage temperaturen . Na enkele minuten koelen dient starter ijskristallen in de houder worden gevormd door " zaaien " de houder . Zaaien wordt uitgevoerd met een programma ( bijvoorbeeld , forceps ) die vooraf zijn gekoeld in vloeibare stikstof om de houder te raken en veroorzaken ijskristalvorming . Deze starter kristal zal gecontroleerde ijskristalvorming starten op een plek , een veilige afstand van de cellen . Zodra zaaien is voltooid, kan de rest van de koeling hellingen gaan . Wanneer de container bereikt temperaturen tussen -30 en -85 C , de container met de cellen kunnen worden direct in vloeibare stikstof ondergedompeld te voltooien de afkoeling tot -196 C.
Verglazing

Zeer snelle niet-evenwichts chillen procedures zoals vitrificatie gebruiken hogere concentraties van cryoprotectants gekoppeld aan een bijna onmiddellijke bevriezing tarief bereikt door kelderen cellen direct in vloeibare stikstof . Verglazing omzeilt het ijs - kristalvorming fase en beweegt het water rechtstreeks in een glasachtige fase . Verglazing bereikt dezelfde eindpunt zo langzaam invriezen , maar met een snelheid van -3000C/min tegenover 10C/min of meer . Voor verglazing worden cellen meestal geplaatst op het uiteinde van een rietje en overmaat koude beschermend middel wordt verwijderd, waardoor net genoeg zodat de cel vast aan de houder van oppervlaktespanning vóór dompelen in vloeibare stikstof . Omdat invriezen zo snel , de duur van blootstelling aan koude beschermende veel minder , en veel hogere concentraties van koude beschermende middelen kan worden getolereerd door de cel . Opwarming van de cel om het weer normaal metabolische werking moet ongelooflijk snel . Omgaan met verglaasd monsters is veel strenger dan langzaam bevroren monsters omdat zelfs een korte blootstelling aan een temperatuur boven die van vloeibare stikstof een ongeplande opwarming proces en opnieuw bevriezen , wat nadelig is voor de cel kan beginnen .