Molecular Cloning Protocollen

Moleculaire klonering protocollen omvatten het gebruikt voor het definiëren, het isoleren en repliceren van een DNA-sequentie procedures. Traditionele restrictie en ligatie klonen protocollen initiëren DNA fragmentatie met beperkte endonucleasen (enzymen die DNA-strengen afgesneden restrictieplaatsen), DNA-fragment ligatie (de reparatie van breuken in DNA-moleculen), transfectie (de introductie van nucleïnezuur in een cel lichaam) en selectie (het kiezen van individuele genomen voor replicatie). Isolatie

Protocols voor het isoleren van een DNA-fragment, de eerste stap in moleculair kloneren, vaak voorzien van een polymerase kettingreactie (PMR), waarbij cycli van verwarmen en afkoelen tot stukjes DNA amplificeren gebruikt. Om het doel sequentie grootte te bereiken, andere protocollen omvatten DNA sonicatie reactiemengsel enzymdigestie en het gebruik van chemisch gesynthetiseerde oligonucleotiden. Deze protocollen variëren naargelang de grootte en de hoeveelheid geïsoleerd DNA nodig.
Ligation

Protocols
voor ligatie betrekken met behulp van een enzym, DNA-ligase, DNA-moleculen verenigen met een covalente binding. Protocol dicteert combineren DNA-fragmenten, de kloneringsvector, een ligatiebuffer, de DNA-ligase en gesteriliseerd water in een microcentrifugebuis en incubatie overnacht bij 4 graden Celsius.
Transfection

protocollen voor transfectie of infusie DNA in een cel> een niet-virale middelen, vaak omvatten het injecteren DNA direct in het cel cytoplasma. Andere werkwijzen omvatten het gebruik van chemische reagentia, zoals calciumfosfaat en lipiden, de transfectie complex leveren door het celmembraan. Deze methode test de effecten van genetische modificatie op het functioneren van specifieke genen.
Selection

Selection
, of screening, protocollen bepalen welke cellen met succes de DNA-insert en duiden welke cellen isolatie nodig. Een centrifuge oogsten cellen die het getransfecteerde DNA worden vervolgens geïncubeerd in een lysozym (een natuurlijk voorkomend enzym) buffer en behandeld met een alkalische reinigingsmiddel bevatten, waardoor de eiwitten en membranen oplosbaarheid. Met behulp van acetaat naar de eiwitten, een centrifuge en kaasdoek filter de DNA-bevattende supernatant (de oplosbare vloeistof overgebleven uit een gecentrifugeerd verbinding) neer te slaan. De supernatant wordt geprecipiteerd met polyethyleenglycol, gecentrifugeerd en gesuspendeerd in een cesium chloride en ethidium bromide buffer. De ethidiumbromide vlekken het DNA volgens dichtheid, en met behulp van een lange-golf UV-licht, wordt de lagere-band DNA geëxtraheerd met een vijf cc spuit. Een evenwicht ionenwisselaarkolom scheidt het DNA uit het ethidiumbromide en cesium chloride en de uiteindelijke DNA pellet wordt gesuspendeerd in een bufferoplossing en gedetecteerd op agarose gelelektroforese.