Celoppervlak Biotinylatie Protocol

Biotinylering gebruikt het vermogen van het oplosbare vitamine biotine te binden aan cel eiwitten . Biotine bindt aan het eiwit streptavidine en is daarom nuttig celbiologie naar cel eiwitten te visualiseren . Biotinylering kan veilig etikettering van eiwitten vergeleken met technieken zoals radioactiviteit en heeft geen invloed op de normale functie van de cel . Het stelt onderzoekers naar cel eiwitten zoals receotiren en dat een beter begrip van ziekten en ziekteprocessen maakt . Labeling gesuspendeerde cellen

wassen cellen in ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing ( PBS ) om verontreinigingen te verwijderen . Buffers met Tris en glycine zal concurreren met biotinylering en moet worden vermeden . Om biotinylerende interne eiwitten voorkomen , kan het etiket worden uitgevoerd bij 4 ° C of in aanwezigheid van azide . Resuspendeer cellen in PBS en de oplosbare biotine , sulfo - NHS - LC - biotine .
Labeling hechtende cellen

wassen cellen in PBS en geïncubeerd met een product zoals sulfo - NHS - LC - biotine . De cellen worden vervolgens geschraapt in een schaal en gelyseerd in een buffer die het detergent Triton X - 100 en voorbereid voor visualisatie .
Voorbereiden gelabelde cellen

Na incubatie worden de cellen tot een pellet gecentrifugeerd en gewassen in PBS . De cellen worden opnieuw gesuspendeerd in PBS en gezuiverd met IgG- Sepharose gel . Het gebonden eiwit wordt verdund in laadbuffer en verwarmd tot 100 graden Celsius .
Visualiseren Cellen

Verdund eiwitten kunnen worden gevisualiseerd met behulp van natriumdodecylsulfaat -polyacrylamidegelelektroforese ( SDS - PAGE ) gevolgd door blotting met het eiwit en enzym mix , streptavidine - mierikswortel peroxide . Vlekken worden gevisualiseerd met een chemische reactie --- chemieluminescentie --- die licht uitzendt . Specificiteit van de biotinylatie kan worden bevestigd met antilichamen voor het eiwit onder studie .