Hoe een FRET Gehalte voeren

Fluorescentie resonantie energieoverdracht ( FRET ) is een test techniek om de aanwezigheid en hoeveelheid binding tussen twee gekoppelde reporter eiwitten te meten . Deze test wordt vaak gebruikt om potentieel bindende eiwitten analyseren verschillende soorten cellen , en de doeltreffendheid van conjugatie -achtige enzymen te meten . De instrumentatie nodig is hangt grotendeels af van de soorten reportermoleculen worden gebruikt, hoewel vaak een eenvoudige 96 putjes plaatlezer worden gebruikt . Wat je nodig hebt
Protein-of-interest/Reporter molecuul constructen voor elk eiwit wordt getest
96 -well plaat blok
96 -well plaat lezer
Reaction buffer ( algemeen Tris - of fosfaat - gebufferde zoutoplossing - based ) op Twitter Vervoeging enzym ( indien nodig)
Toon meer instructies
Setup en Reading
1

Genereer of bereiden fusieconstructen van elk eiwit van belang , met elk zijn gekoppeld aan een fluorescentie - transmissie molecuul zoals groen fluorescerend eiwit ( GFP ) , rhodamine of boor - dipyrromethene ( BODIPY ) . kopen van 2

Bepaal absorptie en emissie golflengten van elke fluorescerende component en van de totale test . ( Indien bijvoorbeeld de test meet GFP - > rhodamine fluorescentie- energieoverdracht , de ingang absorptie golflengte die van GFP de absorptie ( 488 nm ) en de emissie detectie golflengte dat voor rhodamine ( 595 nm ) ) op .
3

geschikte reactiebuffer Maak het experiment , afhankelijk van de eiwitten van belang biochemische eigenschappen . Een TRIS - gebaseerde buffer vaak gebruikt , zoals calciumchloride en 0,05 procent Tween - 20 . Specifieke concentraties en componenten kunnen worden bepaald door te zoeken naar journaalboekingen details van dergelijke reacties en omstandigheden .
4

Meng de twee reporter - geconjugeerde eiwitten van belang in verschillende concentraties in de reactiebuffer en aliquot 50-200 ul per putje . Voeg een conjugatie enzym ( bijvoorbeeld sortase ) aan elk monster en indien nodig . Als het uitvoeren van een eindpunt assay , laat incubatie bij kamertemperatuur (of enzym optimale temperatuur) gedurende een bepaalde periode , lees dan op 96 -well plaat lezer . Als het uitvoeren van een kinetische analyse , direct doorgaan naar het lezen ( zie hieronder ) .
5

Insert monster plaat in 96 - well plaat lezer . Maak een nieuw experiment en maak gebruik van de menu-instellingen . Voer het juiste absorptie ( excitatie ) en emissie golflengten , selecteer vervolgens de juiste putjes te worden gelezen .

Als het uitvoeren van een -experiment , de tijd - loop van het experiment en de lezingen interval periode ( bijvoorbeeld een keer per 10 minuten ) .

Begin lezen monster .

gegevens analyseren met behulp van Microsoft Excel -grafieken -functie ( of een andere grafische programma zoals GraphPad ) .