Molecular Cloning Protocollen

Moleculaire klonering protocollen omvatten de procedures die worden gebruikt voor het definiëren , het isoleren en repliceren van een DNA-sequentie . Traditionele restrictie en ligatie klonen protocollen initiëren DNA fragmentatie met beperkte endonucleasen ( enzymen die DNA-strengen afgesneden restrictieplaatsen ) , DNA-fragment ligatie ( het herstel van discontinuïteiten in DNA-moleculen ) , transfectie ( de introductie van nucleïnezuur in een cellichaam ) en selectie ( het kiezen van individuele genomen voor replicatie ) . Isolatie

Protocols voor het isoleren van een DNA-fragment , de eerste stap in de moleculaire klonering , vaak voorzien van een polymerasekettingreactie ( PMR ) , waarbij cycli van verwarmen en koelen gebruikt om stukken DNA te amplificeren . Om het doel sequentie grootte te bereiken , andere protocollen omvatten DNA sonicatie reactie enzymdigestie en het gebruik van chemisch gesynthetiseerde oligonucleotiden . Deze protocollen variëren naargelang de grootte en de hoeveelheid geïsoleerd DNA nodig .
Ligation

Protocols voor ligatie omvatten met een enzym , DNA- ligase , DNA -moleculen met join een covalente binding . Protocol dicteert DNA-fragmenten , de kloneringsvector , een ligatiebuffer , de DNA-ligase en gesteriliseerd water combineren in een microcentrifugebuis en incubatie overnacht bij 4 graden Celsius .
Transfection

protocollen voor transfectie of infusie DNA in een cel met een niet - virale middelen , vaak om injecteren van DNA direct in het cel cytoplasma . Andere werkwijzen omvatten met chemische reagentia , zoals calciumfosfaat en lipiden , de transfectie complexe leveren door het celmembraan . Deze methode test de effecten van genetische modificatie op het functioneren van specifieke genen .
Selection

Selection , of screening , protocollen bepalen welke cellen met succes gehouden de DNA-insert en aangeven welke cellen moeten isoleren . Een centrifuge oogsten cellen die het getransfecteerde DNA , die vervolgens geïncubeerd in een lysozym ( een natuurlijk voorkomend enzym) bevatten buffer en behandeld met een alkalisch reinigingsmiddel , waardoor de eiwitten en membranen oplosbaarheid . Met behulp van acetaat om de eiwitten neer te slaan , een centrifuge en kaasdoek filter instellen voor het DNA-bevattende supernatant ( de oplosbare vloeistof overgebleven uit een gecentrifugeerd verbinding ) . Het supernatant wordt geprecipiteerd met polyethyleenglycol , gecentrifugeerd en gesuspendeerd in een cesiumchloride en ethidiumbromide buffer . De ethidiumbromide kleurt het DNA volgens dichtheid en met een lange golf UV-licht , wordt de onderste band DNA geëxtraheerd met vijf cc injectiespuit . Een evenwicht ionenwisselaarkolom scheidt het DNA van de ethidiumbromide en cesiumchloride , en de uiteindelijke DNA-pellet wordt gesuspendeerd in een bufferoplossing en waargenomen op agarosegelelektroforese .