QuikChange Mutagenèse Protocollen

QuikChange mutagenese is de merknaam van een kit gebruikt in biotechnologisch onderzoek naar genetische mutatie of DNA verandering veroorzaken . Agilent Technologies is het bedrijf achter het product , die beschikbaar zijn in twee versies , QuikChange II en QuikChange Lightning is . Beide sets bevatten een bufferoplossing , het enzym DNA polymerase , kleur reagentia , DNA sequenties of primers en celmonsters . Mutant Strand Synthese Reactie Protocol

Technici synthetiseren twee oligonucleotiden of korte DNA-sequenties die de gewenste mutatie . Vervolgens worden ze controle reactie met de DNA-sequenties , dNTP mix oplossing en DNA- polymerase -enzym , het toevoegen gedestilleerd water . Later , ze bereiden een reeks reacties monster met verschillende concentraties van dubbelstrengs DNA ( dsDNA ) , terwijl primer of oligonucleotiden concentratie constant , volgens de instructies van de fabrikant . Ze houden de monsters bij 203 graden van F 30 seconden . Het monster dat DNA-segment nummer twee is ook getest onder temperatuur fietsen , een techniek waar de temperatuur verandert tijdens een korte periode van tijd. Tenslotte worden de monsters op ijs geplaatst gedurende twee minuten .
Dpn I Digestie van de amplificatieproducten protocol

Dpn I restrictie -enzym knipt het DNA op specifieke plaatsen . Een micro - liter van dit enzym wordt rechtstreeks toegevoegd aan elke amplificatie reakties die standaard met minerale olie met behulp van een micro- pipet of gespecialiseerde aerosolbestendige pipet tip . Echter , is een minerale olie overlay alleen nodig als de thermische cycler , een inrichting gebruikt om DNA-segmenten te amplificeren , heeft geen warme bovenkant samenstel . De reactie is voorzichtig gemengd en later in een micro - centrifuge gedurende een minuut . Daarna worden de monsters geïncubeerd bij 98,6 graden F gedurende een uur .
Transformatie van XL1 -Blue Supercompetent Cellen Protocol

XL1 - Blue is een tetracycline - resistente cellijn die wordt geleverd met de QuikChange Mutagenesis kits. Tijdens dit protocol , technici ontdooien van de cellen , die eerder werden bewaard bij -112 graden F , op ijs . Vul dan ze een micro - liter van de DpnI - behandelde DNA , verwarm het tot 107.6 graden van F 45 seconden en plaats de reactie op het ijs voor twee minuten . Na deze procedure technici voeg een preparaat van NZY ( caseïne hydrolysaat en gistextract ) voorverwarmd tot 107,6 ° C en incubeer gedurende een uur . Het preparaat wordt vervolgens op agar gel borden en geïncubeerd bij 98,6 graden F gedurende 16 uur.