Hoe Antilichaam verdunningen Voeg IHC

immunohistochemie (IHC) is een specialist techniek die wetenschappers cellen in weefsels die zijn geplaatst op een slede en gekleurd met een geschikt antilichaam dat een eiwit dat uniek is voor de cel of herkent visualiseren weefsel in onderzoek. Antilichaam verdunningen (titraties), worden uitgevoerd volgens de experimentele omstandigheden die in eigen protocol van de gebruiker, niet die van de fabrikant van het antilichaam, aangezien de twee niet identiek zijn. Wat je nodig hebt
Cellen om vlekken
Antibody
Verdunningsbuffer ("verdunningsmiddel") op Pipetten en tips
microfugebuis
aluminiumfolie
Lab markers en tube labels
Ice
licht-beschermde preparaatdozen
Toon Meer Aanwijzingen
1

controleren en bereiden het antilichaam. Controleer of het antilichaam is opgewekt in de juiste gastheer, en reageert met de exacte versie van de die wordt getest eiwit (bekend als de isovorm of splice variant). Met behulp van een pipet voorzichtig neem een ​​10 microliter gedeelte van deze en label als 'personal voorraad'.

Als slechts zeer kleine hoeveelheden antilichamen beschikbaar zijn, deze stap overslaan.

Bijhouden van een persoonlijk voorraad van antilichaam is dagelijkse praktijk in alle laboratoria als het kruisbesmetting van de oorspronkelijke voorraad voorkomt. Doseer deze in een licht-beschermde microfugebuis, of een normale microfugebuis die is verpakt in aluminiumfolie om te beschermen tegen direct licht.

Bewaar deze buis op ijs, bij voorkeur in een Esky met een luchtdicht deksel, nogmaals licht, dat het antilichaam kan vernietigen minimaliseren. Noteer de concentratie van de oorspronkelijke voorraad is (bv. 100 eenheden per milliliter, 1 milligram per microliter, enzovoort) op de buis, met inbegrip van de naam van het antilichaam en wat de eventuele, bufferen het wordt verdund in (bijv. serum, zout, of water enz.). kopen van 2

Bereid de verdunning buffer, ook wel bekend als de antilichaamverdunner. Controleer of dit verenigbaar is met het antilichaam en de immunohistochemie procedure wordt gebruikt, bijvoorbeeld, het mag niet verdoezelen fluorescentie of remmen eventuele latere secundaire antilichaam labeling. Wordt standaard immunohistochemie verdunning (ook blokkerende buffer) door mengen 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing met 1% Triton-X100, 10% foetaal kalfsserum en 0,2% natriumazide.

Titreer 3 de antilichaam. Met de gegeven antilichaamconcentratie in de persoonlijke voorraad (uitgedrukt in concentratie-eenheden zoals microgram per microliter), bepalen de hoeveelheid antilichaam die nodig is om 10 microgram antilichaam te verkrijgen.

Stel een verdunningsreeks door pipetteren een volume overeenkomend met 2 microgram antilichaam (bijv. X microliter), in 100 microliter verdunningsmiddel en meng door op en neer pipetteren. Vanuit dit uitgangspunt verdunning, nemen dezelfde X microliter en voeg dat toe aan een volgende 100 microliter verdunner. Herhaal dit tot 8-10 verdunningen (of reeks) bestaat.

Laatste buis derhalve de laagste concentratie en de "verzadigen" concentratie die het hoogste signaal genereren tijdens het experiment . Echter, zal het ideale concentratie de buizen kunnen iets meer geconcentreerd dan dit, zodat niet teveel signaal wordt geproduceerd, waarbij die fouten kunnen veroorzaken.

Label Ga met de nieuwe verdunde concentraties.