Hoe te testen voor nucleïnezuren

Testen op nucleïnezuren wordt uitgevoerd in de medische diagnostiek uitgevoerd om ziekteverwekkers , zoals virussen of bacteriën op te sporen . Deze tests zijn veel sneller en dus zorgen voor een arts om behandeling te starten voor een patiënt die normaal had moeten wachten bevestiging van de besmetting met meer langdurig en vervelend antilichaam gebaseerde assays . De werkwijze is ook bekend als een nucleïnezuur amplificatie testen , en omvat een werkwijze bekend als " reverse - transcriptase amplificatie " door polymerase kettingreactie . Aangezien dit een zeer gespecialiseerde wetenschappelijke procedure , geavanceerde kennis en expertise in moleculaire biologische technieken en theorie nodig is. Wat je nodig hebt
PCR-buisjes
PCR cycler
Pipetten en filter tips
Handschoenen
Cellen
Trizol of andere RNA-extractie reagens
PCR-buffer
Taq-polymerase
RT - PCR-primers op 1 concentratie mg /ml
RNase - vrij water
dNTPs
MgCl2
Random primers bij 1,8 mg /ml concentratie
SuperScript II reverse transcriptase

Toon meer instructies
verwerking en bereiding van RNA
1

Oogst cellen met een RNA-extractie reagens , zoals Trizol . 1 ml is voldoende om cellen te verzamelen uit een putje van een zes -well weefselkweek platen . De cellen worden grondig en neer gepipetteerd om te homogeniseren en vervolgens uitvoeren van de extractieprocedure zoals beschreven in de TRIzol gegevensblad . Kortom , extraheer met chloroform , centrifugeer de fasen van DNA , eiwit en RNA scheiden. Recover alleen de kleurloze RNA- fase en neerslag die met isopropanol . Na incubatie centrifuges dat en het schoonmaken van de resulterende pellet met diverse ethanol wasbeurten. Resuspendeer dan de pellet in RNase - vrij water . Kopen van 2

reverse transcriptie , denatureren precies 5 microgram RNA bij 65 graden Celsius in een 10 microliter ( ul ) volume van RNase - vrij water , dan snel plaats op het ijs . Voor elke reactie , combineer 10 pi RNA , 3 ul 10X PCR- reactiebuffer , 2,5 pi 10 mM dNTP , 6 l 25 mM magnesiumchloride , 1 ul van willekeurige primers van 1,8 milligram per milliliter concentratie en 0,5 ul van SuperScript II reverse transcriptase enzym. Vul elke reactie met 17 ul van RNase - vrij water . Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende tien minuten en vervolgens bij 42 graden Celsius gedurende een uur om het cDNA te produceren , dan denatureren bij 95 graden Celsius en snel ijs om de reactie te stoppen .
3

voor een polymerasekettingreactie opnieuw opzetten van een reactiemengsel in 0,5 ml buizen combineert 6 ul cDNA in de reverse transcriptie reactie , 1,5 ul 10X PCR- reactiebuffer , 0,2 pi Taq -polymerase , 0,5 microliter reverse primer en ook van voorwaartse primer , dan bijvullen elke buis met 10,3 ul van RNase - vrij water . 95 graden Celsius gedurende 0,5 minuut te denatureren , gevolgd door 60 graden Celsius gedurende 45 seconden te gloeien , en tenslotte 72 graden : om de reacties , het opzetten van een PCR-apparaat (bijvoorbeeld een machine die polymeraseketenreacties uitvoert ) voor 30 cycli als volgt draaien Celsius gedurende 1 minuut om de gesynthetiseerde transcript verlengen .