Beperking kiezen Enzymes

Restrictie-enzymen zijn enzymen die zowel enkel- als dubbelstrengig DNA knippen. Elk restrictie-enzym heeft een specifieke nucleotidesequentie, een restrictieplaats genaamd, die het herkent en snijdt. Restrictie-enzymen worden gebruikt voor DNA-sequencing, mutatieanalyse en klonering en amplificatie van DNA. Wetenschappers gebruiken restrictie-enzymen om genen van belang in expressievectoren in te voegen, DNA-moleculen die afzonderlijk van chromosomaal DNA kunnen repliceren. De vector die het gen van belang bevat, kan vervolgens worden geïntroduceerd in een bacteriestam voor expressie en karakterisering van eiwitten.

Identificeer restrictie-enzymplaatsen op uw vector door naar een restrictiekaart te kijken. De restrictiekaart zal u vertellen welke enzymen uw vector zullen knippen en waar.

Kies een restrictie-enzym dat ook een site op uw gen-insert heeft, door te kijken naar de volgorde van de invoegen. Zorg ervoor dat de restrictieplaats zich op een positie op uw insert bevindt die buiten het gen van belang ligt, zodat u geen enkel deel van het gen verliest.

Zorg ervoor dat er geen duplicaten van het gen zijn restrictieplaats overal in uw gen-invoeging of vector. Dit zal meerdere snijwonden in je DNA veroorzaken en je misleidende gegevens opleveren.

Probeer restrictie-enzymen te kiezen die knippen met plakkerige uiteinden, in plaats van stompe uiteinden. Kleverige uiteinden treden op wanneer het enzym dubbelstrengs DNA op een verspringende manier snijdt, waardoor een enkelstrengige overhang overblijft die de bevestiging met een inzetstuk op de tegenovergestelde manier vergemakkelijkt. Blunt eindigt wanneer het dubbelstrengige DNA op een vlotte manier wordt gesneden en deze zijn moeilijker te bevestigen.

Kies een ander restrictie-enzym voor beide uiteinden van uw insert om er zeker van te zijn wordt in de juiste richting in de vector ingevoegd en om ervoor te zorgen dat de vector niet opnieuw aan zichzelf wordt gekoppeld.

Probeer twee restrictie-enzymen te kiezen die goed functioneren in hetzelfde buffersysteem en dezelfde temperatuur . Als dit niet mogelijk is, voert u elke digestie afzonderlijk uit.

Tip

Sommige webprogramma's zijn ontwikkeld om snel restrictiesites op een DNA-sequentie te identificeren. Een van deze programma's is van New England BioLabs.

Benodigde dingen

Volgorde van gen-invoegtoepassingen

Beperkingskaart voor gewenste vector

Lijst van restrictie-enzymen en hun knipplaatsen

, , ] ]