T - celkweek protocollen

T - cellen , die tot een familie van immune cellen genoemd lymfocyten , gegenereerd tijdens een adaptieve immuunrespons . T - cellen afkomstig uit het beenmerg stamcellen en rijpen in de thymus . Er zijn verschillende typen T - cellen , elk met een andere functie . T - cellen worden onderscheiden van elkaar door de bijgevoegde T-cel antigen receptor . Een subset van T - cellen die de CD4- marker draagt ​​en helpt om een immuunrespons te induceren . Bronnen van T - cellen

T - cellen kunnen worden verkregen uit diverse bronnen , waaronder de milt , lymfeklieren en thymus , maar perifeer bloed is de meest gemakkelijk beschikbare bron van T - cellen voor kweek doeleinden . Bloedmonsters worden grondig gescreend op infecties en andere verontreinigingen en zorgvuldig gehanteerd onder een veiligheidskabinet . T - cellen worden gekweekt om verschillende redenen , waaronder toxiciteitsmetingen en immunologische vaccins onderzoeken .
Isolatie

T - cellen worden vaak gescheiden van volbloedmonsters door dichtheid gradiënt scheiding , zoals T - cellen zijn minder dicht dan rode bloedcellen zoals erythrocyten en daarom door centrifugeren gewonnen . Een geschikte neutrale zoutoplossing wordt toegevoegd aan het bloedmonster , gevolgd door een Ficoll isopaque oplossing . Ficoll isopaque een dichtheid groter dan T - cellen, maar minder dan erytrocyten en tijdens centrifugeren vormt een tussenlaag tussen beide cellen , zodat T - cellen van de bovenkant te verwijderen . De T - cellen zijn verder gecentrifugeerd , het supernatant wordt verwijderd en een kleine hoeveelheid wordt gerekend tot de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. De cellen worden ofwel direct gebruikt voor experimenten of cryogeconserveerde voor toekomstig gebruik .
Cryopreservation

Cryopreservation reagentia van tevoren zijn voorbereid om T-cel degradatie bij kamertemperatuur voorkomen temperatuur . Indien dit niet mogelijk is , worden de cellen op ijs bewaard of in de koelkast . Reagentia uit celkweek media en 10-13 procent humaan serumalbumine ( HSA ) eiwit en celkweek media en 10 procent dimethylsulfoxide ( DMSO ) . DMSO minimaliseert uitdroging , pH-veranderingen , en elektrolytconcentratie veranderingen in verband met bevriezing . T - cellen worden opnieuw gesuspendeerd in het reagens dat celkweekmedia en HSA in een cryotube . Het reagens dat DMSO wordt langzaam aan de cellen toegevoegd en voorzichtig gewerveld . De cellen worden vervolgens overgebracht naar een koude isopropanol vat dat een geleidelijke temperatuurdaling waarborgen en opgeslagen .
Ontdooien

Wanneer T - cellen worden ontdooid , een cryotube verwijderd opslag en geïncubeerd bij 37 graden Celsius . Vervolgens wordt het geschikte medium ontdooien langzaam toegevoegd aan de cellen tot tweemaal het volume is bereikt , overgebracht naar een afzonderlijke buis en gecentrifugeerd . Benzonase wordt soms toegevoegd aan het ontdooien medium om de samenklontering van dode T - cellen voorkomen . De gecentrifugeerd pellet wordt gereageerd in celkweek media en de levensvatbaarheid van de cellen wordt beoordeeld . De T - cellen zijn dan klaar om te gebruiken voor desbetreffende experimenten .